La esterilización real en tanque (esterilización real) es un proceso de esterilización en el que todo el medio de cultivo preparado se introduce en un biorreactor-fermentador. u otro dispositivo, se introduce vapor para calentar el medio de cultivo y el equipo utilizado hasta la temperatura de esterilización, se mantiene durante un cierto período de tiempo y luego se enfría hasta la temperatura de inoculación, como se muestra en la Figura 1.
Figura 1 Diagrama esquemático de la eliminación real.
Este proceso también se denomina esterilización intermitente o esterilización por lotes (en relación con la esterilización continua).
La operación de esterilización de tanque lleno en realidad incluye tres procesos: calentamiento, preservación del calor y enfriamiento. La Figura 2 muestra los cambios de temperatura durante la esterilización del tanque lleno del medio de cultivo.
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Figura 2 Cambios de temperatura durante la esterilización de latas
Pasos específicos para la esterilización de latas:
1. Inspección de limpieza de tanques
Antes de limpiar, verifique si el estado de la válvula es correcto. Al limpiar, preste atención para comprobar si hay fugas en el equipo y las tuberías, principalmente en las tuberías de refrigeración.
Compruebe si se ha drenado el agua condensada en la camisa del fermentador para asegurarse de que no haya agua de refrigeración en la camisa.
Después de la limpieza, revise el interior del tanque para ver el color original sin suciedad evidente.
2. Preparación antes de la esterilización
Esterilice el filtro de aire del fermentador y séquelo con aire esterilizado.
Verifique para asegurarse de que el tanque esté despresurizado. Inserte el electrodo limpio y calibrado en el tanque y conecte el cable del electrodo. Verifique que la válvula del fondo del tanque esté cerrada.
Luego agregue los materiales preparados al tanque, agregue el agua requerida para completar el volumen de acuerdo con los requisitos del proceso, agregue el antiespumante y verifique si falta algún material. Una vez finalizado, revuelva para evitar que el líquido se asiente.
3. Calefacción
(1) Calentamiento indirecto
Abra las válvulas de escape del cuerpo del tanque, al mismo tiempo cierre el agua de refrigeración de la camisa, abra la válvula de vapor de la camisa o del serpentín, introduzca vapor en la camisa o serpentín para calentar indirectamente el líquido, abra ligeramente el drenaje del tubo de entrada de agua de la camisa válvula y descargue el agua condensada en el cuerpo y la camisa del tanque.
Cuando la temperatura del tanque aumente a 80-90 ℃, cierre gradualmente la válvula de escape.
El papel del precalentamiento del vapor de la camisa:
①Reduzca la generación de agua condensada y garantice la precisión del volumen del medio de cultivo después de la desinfección.
Al principio, el vapor se introduce directamente en el tanque y el material frío del tanque se precipita directamente al vapor, lo que es muy probable que produzca una gran cantidad de agua condensada y haga que el volumen del medio de cultivo sea demasiado grande después del consumo. . Algunas fábricas omiten este paso y necesitan controlar la cantidad de agua condensada generada mediante experimentos para asegurar la concentración del medio de cultivo.
②Reducir el ruido.
La diferencia de temperatura entre el material y el vapor es demasiado grande y la introducción directa de vapor provocará vibraciones en el equipo.
③ Favorece la gelatinización y licuefacción de materias primas con almidón. (Esto no se aplica a materias primas sin almidón)
La temperatura de la camisa aumenta relativamente lentamente, lo que es beneficioso para la disolución completa de los materiales que pueden no disolverse completamente en el medio de cultivo para materiales con almidón, y evita la gelatinización y aglomeración de la superficie del material causada por un aumento de temperatura demasiado rápido, que afecta el efecto de esterilización.
(2) Calentamiento directo
Después de precalentar la chaqueta a 80-90 ℃ , cierre la válvula de entrada de vapor de la chaqueta (también se puede cerrar), abra la válvula de entrada de vapor del tanque y permita que el vapor fluya directamente hacia el tanque para elevar la temperatura del tanque a 118-121 ℃ . Abra varias válvulas de escape y deje de revolver.
4. Aislamiento térmico y de presión.
Cuando la temperatura del material esté cerca de la temperatura especificada por el proceso, reduzca gradualmente la válvula de vapor y ajuste el equilibrio de cada válvula para que la presión y la temperatura alcancen constantemente la presión y la temperatura requeridas por el proceso (generalmente ligeramente más altas que la temperatura del cultivo). entre 0,5 y 2 ℃, de lo contrario bajará demasiado).
En este momento, se requiere que todas las tuberías conectadas al reactor estén en dos estados: entrada de vapor o salida de vapor, para esterilizar las tuberías.
Durante la etapa de aislamiento, se debe introducir vapor en todas las tuberías por debajo del nivel del líquido del medio de cultivo; El vapor debe descargarse de otras tuberías por encima del nivel del líquido, para garantizar una esterilización completa sin rincones muertos. El aislamiento es generalmente de 121 ℃ durante 25 a 30 minutos.
de fermentación generales generalmente tienen tres aberturas (tubo de entrada de aire, tubo de descarga y tubo de muestreo) para la entrada de vapor, que es la llamada "entrada de vapor de tres vías".
"Salida de vapor de cuatro vías" significa que el vapor se descarga directamente desde los tubos de escape, inoculación, alimentación y antiespumante. Principalmente de estas cuatro vías, también es necesario abrir las válvulas de entrada y salida de vapor.
5. coling
Después de la esterilización, primero cierre todas las válvulas de entrada de vapor y reduzca ligeramente la válvula de escape. Luego, abra la válvula de entrada de aire para dejar entrar aire estéril y mantener la presión del tanque. Cabe señalar que la presión en el tanque debe ser menor que la presión del filtro de aire para evitar que el medio de cultivo regrese.
Finalmente, abra la válvula de agua de enfriamiento y pase agua fría a través de la camisa o serpentín para un enfriamiento rápido, comience a agitar y enfríe el medio de cultivo a la temperatura requerida por el proceso de fermentación .
Después de la esterilización, es necesario introducir aire estéril a tiempo para garantizar la presión dentro del tanque (generalmente la presión del tanque se ajusta a 0,1 MPa) antes de agregar agua de refrigeración para enfriar.
La función de introducir aire estéril es acelerar el enfriamiento y mantener la presión positiva en el tanque, para evitar que el enfriamiento del medio de cultivo forme una presión negativa en el tanque, que es fácil de infectar con bacterias o causar que el biorreactor- el fermentador se dañe (la presión del tanque del biorreactor-fermentador cae a cero y el cuerpo del tanque se succiona). Este es un accidente que ocurre a menudo en la operación de esterilización de tanques de fermentación con camisa de acero inoxidable . Este es un grave accidente de producción.
Se utilizan los siguientes cuatro criterios para juzgar la calidad de la esterilización de los tanques de medios de cultivo:
① Cumplir con los requisitos de esterilidad después de la esterilización;
②Menos destrucción de nutrientes;
③ El volumen del medio de cultivo después de la esterilización es consistente con el volumen de alimento;
④Menos espuma.
Se debe prestar atención a varias cuestiones durante el proceso de esterilización:
(1) El papel de la agitación de esterilización.
En la esterilización de latas llenas, la agitación juega un papel muy importante.
El propósito de activar la agitación:
① Calentar y transferir uniformemente los materiales esterilizados para evitar la formación de presión falsa durante el proceso de esterilización de la lata;
② Evite la sedimentación del material. Una vez que se produce la sedimentación y la estratificación, provocará una temperatura de calentamiento inconsistente y generará fácilmente una presión falsa.
(2) Cambios en el volumen del líquido después de la esterilización.
Al preparar el medio de cultivo, se debe prestar especial atención al aumento de volumen del medio de cultivo después de la esterilización.
Cuanto mayor sea el tiempo de esterilización, más aumentará el volumen. Cuanto más baja es la temperatura, mayor es el volumen de vapor que entra, aumentando generalmente alrededor del 10%, lo que está relacionado con la calidad del vapor.
La camisa no se precalienta o no se precalienta lo suficiente, el agua condensada en la tubería de vapor no se drena por completo, el vapor enviado desde la sala de calderas contiene demasiada agua, etc., lo que formará una gran cantidad de agua condensada y aumentará el volumen.
(3) Consideración del tiempo de esterilización de las latas.
En la producción de fermentación industrial , la etapa de conservación del calor suele considerarse como el tiempo de esterilización. Ahora se utilizan generalmente 121 ℃ y 30 min.
Sin embargo, el tiempo de mantenimiento de la esterilización necesario para lograr el mismo efecto de esterilización en fermentadores de diferentes tamaños es teóricamente diferente.
Los 40m3 El biorreactor-fermentador se esteriliza y el tiempo de esterilización teórico se calcula mediante la fórmula.
Figura 4 Calcular el tiempo teórico de esterilización.
t——indica el tiempo de esterilización teórico, s;
N0——el número original de bacterias viables al comienzo de la esterilización (t=0), células/ml;
Nt——Número de bacterias vivas restantes después del tiempo t, células/mL;
k——constante de tasa de muerte bacteriana, s-1, que está relacionada con el tipo de microorganismo y la temperatura.
Suponga que el medio de cultivo contiene 2 × 107 esporas de bacterias resistentes al calor/ml y que la velocidad de esterilización constante a 121 ℃ es 0,0287 s-1.
El tiempo necesario para obtener la probabilidad de fallo de esterilización de 0,001 es de 23,9 minutos. Aquí no se tiene en cuenta el efecto de esterilización de las dos etapas del medio de cultivo que aumenta desde la temperatura ambiente hasta 121 ℃ y cae desde 121 ℃ hasta la temperatura del cultivo de fermentación .
De hecho, el calentamiento y el aumento de temperatura contribuyen a la esterilización del medio de cultivo, especialmente cuando el medio de cultivo se calienta por encima de 100 ℃ , este efecto es más obvio.
Si se tiene en cuenta el efecto de esterilización del medio de cultivo durante la etapa de calentamiento, y si se necesitan 15 minutos para elevar la temperatura del medio de cultivo de 100 ℃ a 121 ℃ , el tiempo de esterilización durante la etapa de aislamiento se calcula en 21,1 minutos y el tiempo de aislamiento se reduce en un 12%.
Cuanto mayor sea el volumen del tanque de fermentación , mayor será el tiempo de calentamiento para la esterilización del tanque, mayor será el impacto de la etapa de calentamiento en la esterilización y más corto será el tiempo de aislamiento correspondiente.
Los tanques pequeños se calientan rápidamente y se puede ignorar el tiempo de calentamiento. Los tanques de fermentación utilizados actualmente en la industria de la fermentación son relativamente grandes (60-100 m3) y se debe considerar el efecto de esterilización durante la etapa de calentamiento para minimizar la destrucción de nutrientes.
Para tanques de fermentación con un volumen inferior a 40 m3, este efecto puede ignorarse.
Además, la etapa de enfriamiento también contribuye en cierta medida a la esterilización, pero hoy en día se utilizan comúnmente medidas de enfriamiento rápido, que duran poco tiempo y generalmente no se tienen en cuenta en los cálculos.